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多元 PCR 引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化的一般規(guī)律
日期：2025-01-08 18:23
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摘要：
當(dāng)設(shè)計(jì) MPCR 引物時(shí)，除了引物設(shè)計(jì)的一般規(guī)律外，其他一些因素也必須考慮。一般 來說，一個(gè)多元反應(yīng)中使用的所有引物的 Tm 值應(yīng)該接近，要避免 3'-核苷酸互補(bǔ)，每一對引物應(yīng)獨(dú)立地優(yōu)化其反應(yīng)條件。一旦將引物集中，需按順序混合，然后再進(jìn)行優(yōu)化。
1. 引物長度應(yīng)為 18~24 個(gè)堿基，較長的引物更容易形成引物二聚體。
2. 對于 MPCR，退火溫度和循環(huán)數(shù)非常關(guān)鍵。要盡可能提髙退火溫度，要確認(rèn)每一對 引物單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)的退火溫度，然后在多元 PCR 反應(yīng)時(shí)采用zui低的退火溫度。同樣，要采用zui少的擴(kuò)增數(shù)...
當(dāng)設(shè)計(jì) MPCR 引物時(shí)，除了引物設(shè)計(jì)的一般規(guī)律外，其他一些因素也必須考慮。一般 來說，一個(gè)多元反應(yīng)中使用的所有引物的 Tm 值應(yīng)該接近，要避免 3'-核苷酸互補(bǔ)，每一對引物應(yīng)獨(dú)立地優(yōu)化其反應(yīng)條件。一旦將引物集中，需按順序混合，然后再進(jìn)行優(yōu)化。
1. 引物長度應(yīng)為 18~24 個(gè)堿基，較長的引物更容易形成引物二聚體。
2. 對于 MPCR，退火溫度和循環(huán)數(shù)非常關(guān)鍵。要盡可能提髙退火溫度，要確認(rèn)每一對 引物單獨(dú)擴(kuò)增時(shí)的退火溫度，然后在多元 PCR 反應(yīng)時(shí)采用zui低的退火溫度。同樣，要采用zui少的擴(kuò)增數(shù)。
3. 由于多個(gè)模板同時(shí)擴(kuò)增，酶量和核苷酸濃度可能成為限制因子，而且完全合成所有 產(chǎn)物所需的時(shí)間增加。因此，優(yōu)化每個(gè)反應(yīng)的試劑濃度和延伸時(shí)間就顯得非常重要。相對于 單個(gè)目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸時(shí)間較長。