操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨(dú)純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。

2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3、每107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產(chǎn)品只適合于動(dòng)物材料，不適合于植物材料，因?yàn)橹参锞€粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。

產(chǎn)品組成:

使用方法:

一:培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理

1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞,離心收集后棄上清。

2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次,離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二:組織細(xì)胞預(yù)處理

3. 用剪刀將1g新鮮的動(dòng)物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動(dòng)物組織,因?yàn)閮瞿^程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。

三:血液預(yù)處理

4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細(xì)胞層。

5. 用自備PBS洗滌白細(xì)胞兩次,得到的白細(xì)胞沉淀用于mtDNA提取。

柱式動(dòng)物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取

5.在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。

6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻10次。千萬不要?jiǎng)×艺袷帯?/span>

7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。

8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。

9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大,有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?，F(xiàn)象,取上清時(shí)避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。

11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。

12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。

注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。

13. 重復(fù)上步1次。

14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中)。

15. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預(yù)熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。

16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強(qiáng),如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當(dāng)于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。

18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于DNA機(jī)械斷裂,電泳時(shí)DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒家族受體α-4抗體流式組化

腸出血性大腸埃希菌（Enterohaemorrhagic E. coli）鑒定16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒20次磷脂?；嫉鞍拙厶?3抗體流式組化

腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E. coli）鑒定20次癌易感基因相關(guān)蛋白2

16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒CD90抗體流式組化

腸集聚型大腸埃希菌（Enteroaggregative E. coli）鑒定20次L-谷氨酸二乙酯鹽酸鹽

16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒D-半胱氨酸

腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E. coli ）鑒定20次牛血紅蛋白

16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒γ-球蛋白（牛）

副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus）鑒定20次頭孢曲松鈉

16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒環(huán)孢菌素A

霍亂弧菌（Vibrio cholerae）鑒定20次2′-脫氧肌苷

16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒羥丙基-β-環(huán)糊精

耶爾森氏菌屬（Yersinia）鑒定20次羧甲基纖維素CM-32

16S rDNA PCR擴(kuò)增檢測試劑盒苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF

沙門氏菌（Salmonella）鑒定20次亞精
人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒W家族RT-PCR試劑盒BIRC5/FITC  熒光素標(biāo)記凋亡抑制因子5抗體IgGN-乙酰-DL-谷氨酸 BR

CD203c/FITC  熒光素標(biāo)記CD203c抗體IgGN-乙酰-L-氨基乙酰 BR

CD203c/RBITC  紅色熒光素羅丹明(RBITC)標(biāo)記抗CD203c抗體IgGN-乙酰-L-羥脯氨酸 BR

BNP/HRP  辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗人腦鈉素抗體IgGN-乙酰-D-脯氨酸  98%

CD31/HRP  辣根過氧化物酶標(biāo)記CD31抗體IgGN-乙酰-D-酪氨酸 BR

BK channel/FITC  熒光素標(biāo)記BK通道蛋白抗體IgGL-氨酰鹽酸鹽 97%

BKCa channels/FITC  熒光素標(biāo)記鈣激活通道蛋白抗體IgGDL-a-氨基己二酸 96%

Bmi1/PCGF4/FITC  熒光素標(biāo)記組蛋白相關(guān)Bmi1抗體IgGBoc-L-谷氨酰 98%