商品屬性：

儲存條件：

pBM26 Toposmart Cloning Kit（gateway系統(tǒng)入門 TOPO克隆載體）-20℃保存

產(chǎn)品介紹：

利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將PCR產(chǎn)物定向克隆到線性化的pBM26載體中。適用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物。pBM26載體類似于invitrogen公司的pENTR/D-TOPO入門載體，具有attL1和attL2，為gateway系統(tǒng)中的入門載體。引物M13F(-21)r和M13R可用于菌落PCR和測序鑒定。

產(chǎn)品特點：

(1) 連接反應(yīng)僅需 5 分鐘。
(2) 只適合平末端 PCR 產(chǎn)物的快速、高效、定向克隆。
(3) 載體采用了新的制備工藝，零背景，無需藍(lán)白斑篩選
(4) 可在基因的 C 端中融合 Flag 標(biāo)簽序列。
(5) 載體為卡那霉素抗性。

注意事項：

(1) 引物要求：PCR 引物 5’端不能進(jìn)行磷酸化修飾，普通商業(yè)化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四個堿基（CACC 為真核表達(dá)所必需的Kozak 序列）。如果目的蛋白需要在 C 端帶 FLAG 標(biāo)簽，下游引物則需要去掉基因本身的終止密碼子（3 個堿基），目的蛋白的翻譯終止由 FLAG 標(biāo)簽的終止密碼子 TAA（位于 Xho I 酶切位點前）來實現(xiàn)。
(2) DNA 聚合酶：選用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 擴增。
(3)連接時間：5-15 分鐘，一般為 15 分鐘。
(4)連接溫度：室溫 (22℃-30℃)，可使用PCR儀控溫。*佳反應(yīng)溫度為25℃。若片段有高GC等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，可在37℃反應(yīng)。
(5)產(chǎn)物要求：為保證PCR產(chǎn)物完整，建議72℃后延伸5-10分鐘。連接前使用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和純度，如PCR產(chǎn)物為非單一性條帶，目的片段一定要切膠回收。如PCR產(chǎn)物為單一條帶，無引物二聚體，可以取1-3?l的PCR產(chǎn)物直接連接。但若擴增模板為質(zhì)粒DNA，應(yīng)注意質(zhì)粒的抗性。由于pBM26載體為卡那抗性，以氨芐抗性的模板質(zhì)粒擴增的PCR產(chǎn)物直接連接后的產(chǎn)物可涂布在卡那抗性的LB平板上。以卡那抗性的模板質(zhì)粒擴增的PCR產(chǎn)物應(yīng)切膠回收后再連接。
(6)片段用量：膠回收的DNA片段一般使用量為50-100ng。對照片段為5’端帶CACC四個堿基的全長EGFP基因的平末端產(chǎn)物。
(7)在M13F(-21)和M13R引物干粉管中加120?l**水即為5?M濃度的引物。

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